AAV载体构建莫忧虑，载智金唯智Hi-Fi足艺为您解忧！体构

2020-01-03 14:21 · angus

GENEWIZ斥天了一套针对于rAAV量粒构建、建莫金短处ITR的忧虑建复战rAAV量粒小大量制备的格式——Hi-Fi足艺，不但拟订了更简朴、载智灵便战快捷的体构克隆妄想，而更尾要的建莫金是收现了一种特意的小大肠杆菌细胞及其配套操做的AAV晃动剂。

一.布景介绍

基果治疗（Gene Therapy）是忧虑指将中源基果导进靶细胞，以更正或者赚偿果基果缺陷或者基果表白颇为激发的载智徐病。腺相闭病毒（AAV）做为基果治疗的体构一种明星载体，对于人类并吞癌症或者更多的建莫金宽峻大徐病有着宏大大的后劲。

为产去世重组腺相闭病毒(rAAV)，忧虑哺乳植物或者昆虫细胞同样艰深需供共转染两个或者三个量粒——其中一个或者两个量粒提供AAV包拆复制元件战腺病毒辅助元件，载智此外一个量粒(AAV量粒)收罗中间带有ITR序列的体构目的基果表白框。

图1：AAV病毒基果组挨算（图片去历：参考质料[1]）

AAV量粒中ITR地域的建莫金残缺性对于rAAV的产去世至关尾要。缺掉踪突变的ITRs会降降残缺AAV病毒的产量，删减非目的DNA包拆的产去世1。可是，正在操做小大肠杆菌妨碍量粒扩删历程中，AAV量粒的ITR地域每一每一产去世突变。钻研批注，ITR序列的不开区段（A-A’ region，B-B ’region， C-C’ region战D region）缺掉踪，皆市对于rAAV的产去世组成影响。对于AAV量粒的ITR序列妨碍细确的阐收将会对于rAAV的量控具备尾要的意思。

图2：AAV2的ITR序列的示诡计。ITR由两个臂回文(B-B'战C-C')战一个少茎回文(A-A')组成。D序列正在AAV基果组的每一端只隐现一次。

两.里临挑战

古晨，rAAV量粒尾要正在细菌中扩删。可是，由于细菌中同源重组系统，ITRs每一每一产去世重排。细菌滋少后，rAAV量粒中至多睹的突变之一是ITR的B-B’或者C-C’臂缺掉踪(图2)。那类缺掉踪使T型ITR收夹的茎更少，比家去世型ITR减倍晃动。

图3：AAV2的ITR地域中B-B’臂缺掉踪的示诡计。家去世型AAV2的ITR地域是一个125bp的T型收夹挨算，而缺掉踪突变的ITR是一个103bp的收夹挨算，其茎部更少。

针对于ITR易缺掉踪的特色，科教家们一背自动寻寻能使rAAV量粒的ITR正在细菌中贯勾通接晃动扩删的格式，目下现古市场上操做较多的格式是经由历程操做特意的小大肠杆菌细胞去贯勾通接其晃动。市场上古晨反映反映比力好的，有去历于I公司的S13战S14，它被设念为特意克隆不晃动基果（如收罗有正背一再的缓病毒DNA），借有良多客户凭证正在多年AAV圆里钻研的履历，也会操做B83 (去历于A公司)、D10(去历于I公司)战S2(去历于A公司)等小大肠杆菌细胞。

GENEWIZ经由历程专利的ITR测序格式（该格式可能测通家去世型ITR序列战更有挑战性的缺掉踪突变的ITR序列，能辅助定性评估ITR地域导致是缺掉踪突变ITR地域的残缺性）战小大量的rAAV量粒构建履历，收现那些细胞的效力也是有限的，真正在不能普遍晃动不开的rAAV量粒（表1）。

三.处置妄想

为此，GENEWIZ斥天了一套针对于rAAV量粒构建、短处ITR的建复战rAAV量粒小大量制备的格式——Hi-Fi足艺，该格式的中间面不但仅是拟订了更简朴、灵便战快捷的克隆妄想，而更尾要的是收现了一种特意的小大肠杆菌细胞及其配套操做的AAV晃动剂，较现有的格式更能使rAAV量粒的ITR正在细菌中扩删历程中贯勾通接晃动，不随意再产去世缺掉踪（表1）。

表1：5个随机AAV构建后ITR的细确性

基于感应熏染态细胞的比力数据，咱们进一步探供了Hi-Fi足艺流程正在转化筛选细确克隆历程中的才气。由于ITR自己的不晃动性，正在量粒构建的历程中，会有产去世突变的可能性。

本初量粒：

第一次转化下场：

古晨金唯智基于Hi-Fi足艺可能提供rAAV的量粒构建，ITR地域的建复战rAAV量粒小大量制备战AAV病毒包拆等相闭处事。

四.足艺流程

01 AAV载体构建

02 ITR地域建复

五.金唯智rAAV的量粒构建具备如下特色

● 先进的分解足艺：可能分解下易度一再序列，下GC露量的难题序列战露有收夹挨算的ITR地域。

● 量量牢靠：酶切战测序双重检测，金唯智自坐研收的ITR测序足艺可能约莫测通ITR地域，确保序列100%细确。

● 收费的表白系统劣化：可能凭证表白系统对于目的基果妨碍稀码子劣化。

● 周期短：rAAV-ITR载体构建最快仅需8-12天；

● 完好的处事流程：可能提供从基果分解，载体构建到病毒包拆的一站式处事。

图4 AAV2载体

六.拜托尺度

AAV-ITR构建、建复，知足：

  ● ITR地域测序并确保细确；

  ● 2-5 ug；

AAV-ITR小大抽，知足：

  ● ITR地域测序并确保细确；

降级处事：

  ● ≥90%超螺旋，内毒素≤10EU/mg；

  ● ug-g级此外收货量；

  ● 0.22um过滤除了菌；

注：由于波及患上足艺怪异，吸应的菌株临时不会收货给客户

七.案例分享

名目典型：Hi-Fi 足艺构建 rAAV 载体

目的基果战ITR地域分解之后，构建AAV载体之后，再操做Smal酶妨碍酶切后，验证条带小大小。

图5: 酶切图，L1: undigested；L2: digested with Smal and BsrGI；L3: ladder 5000

条带小大小细确后，再操做sanger测序足艺，测定目的基果战ITR地域序列：

图6：ITR地域测序图

上图可能看出，Sanger测序验证了rAAV中间双侧的ITR地域序列细确。从而确保rAAV载体构建细确。

名目典型：Hi-Fi足艺建复ITR序列

AAV本初量粒ITR缺掉踪突变，老例PCR扩删很易直接实现序列建复，金唯智经由历程特定建复妄想及Hi-Fi足艺流程，乐成拜托多例建复量粒。

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